鹅膏肽类*素是引起蘑菇中*的主要因素，占蘑菇中*的90%。在鹅膏肽类*素中，*笔*肽是引起中*最快的*素。因此，构建快速高灵敏定量方法诊断蘑菇中*至关重要。本研究构建了一种基于磁珠的快速自动化化学发光免疫分析（CLIA）方法用于蘑菇中*早期快速诊断。在人血清中*笔*肽检测限为0.ngmL-1，人尿液中检测限为0.ngmL-1。回收率范围为81.6%-95.6%，变异系数小于12.9%。本方法对鹅膏肽类*素样品分析结果与HPLC-MS/MS结果一致。由于使用磁珠作为载体，以化学发光作为检测信号，使用集成的自动化设备执行整个过程，这种基于磁珠的化学发光免疫分析具有高的灵敏度，可重复性和稳定性优势。因此，提出的基于磁珠的自动化化学发光免疫分析对于蘑菇中*早期快速临床诊断极具前景。
因误食*蘑菇而导致食物中*事件每年都在发生，在美国，蘑菇中*大概占食物中*事件总数的5.8%。此外，蘑菇中*在中国具有高死亡率，根据中国国家食品安全风险评估中心的数据，蘑菇中*占据食源性中*疾病的13.3%并且具有20.9%的死亡率。值得注意的是，蘑菇中*事件中，90%的死亡是由鹅膏菌属多肽引起的。目前为止，已经从*蘑菇中分离出22种天然鹅膏肽类*素。根据它们的氨基酸组成和结构，鹅膏肽类*素可以分为三类：鹅膏*素，*笔*素和伞*素。其中*笔*素中*最快，2-5小时内可引起小鼠死亡。经口摄入*笔*肽后，30h内可在血清中检测到，72小时内可在尿液中检测到。因此，对于患者而言很有必要快速早期诊断蘑菇中*，尤其是*笔*素中*。化学发光免疫分析（CLIA）是一种结合了化学发光和免疫反应的分析方法，具有高灵敏度，宽的检测范围及无放射污染的优势。目前已经广泛应用于生命科学，环境监测，食品安全和药物分析领域。常规CLIA方法使用96孔板或者NC膜作为载体偶联抗体/抗原。然而这种载体特异性表面积低，影响抗原抗体识别效率和灵敏度。磁珠具有特异性表面积大，磁性强及生物相容性好的优势，可以作为现代诊断载体或者分散工具。同时，基于磁珠的免疫分析可以通过外部磁场方便操作，自动化检测，比如省去加样，甩板及洗板操作，并且提高了检测通量及重现性。这项研究中，构建了基于磁珠的自动化化学发光免疫分析方法，用于检测人血清和尿液中二羟*笔*肽（PHD）和羧基二羟*笔*肽（PCD）。磁珠作为间接竞争免疫分析平台中的免疫原载体。通过生成化学发光信号，可以高灵敏度对*笔*肽进行定量。通过预制项目，整个CLIA过程可以自动化执行。1制备免疫磁珠
首先制备生物素化的包被原。将活化的生物素（10μL）和PCD-OVA（μL）混合，室温避光反应4h。产物使用滤膜（10kD）超滤三次获得生物素化的包被原。然后将稀释的生物素化包被原（2μgmL-1）加入MB-Avi（亲和素标记的磁珠）溶液放入微型振荡器室温反应30min。由于生物素和亲和素的高亲和力，包被原被连接到磁珠表面。最后将免疫磁珠（MBs-OVA-PCD）用PBST洗涤两次，重新溶解到μgmL-1，4度储存。
2基于MB的自动化CLIA装置及其原理首先，将以下液体依次预装载到7列深孔板中，竞争试剂（20μLMBs-OVA-PCD，40μL3F9抗体溶液），第一次洗涤液（μLPBST），第二次洗涤液（μLPBST），酶标二抗（μLHRP标记的羊抗鼠抗体），第三次洗涤液（μLPBST），第四次洗涤液（μLPBST），化学发光底物（μL发光胺和过氧化氢混合物）。然后将不同浓度的*笔*肽加入第一列深孔，就可以执行自动化免疫分析过程。基于三轴机械臂线性组件，构建了三轴机械臂操纵模块。使用AMC软件控制三轴机械臂马达，进而精确控制三轴机械臂线性移动，包括点移动，往返移动，分段移动，以特定速度和距离返回原点移动，这些运动可以通过预编辑项目来控制。通过磁珠控制模块操纵磁棒和搅拌套，以实现磁珠的自动化分离，转移和重悬。自动化的化学发光免疫分析包括以下步骤：（1）在第一列孔中，在室温下搅拌棒深入液面以下上下移动（50次/分钟）15分钟。然后将磁棒载入搅拌套，搅拌套底部收集到磁珠，持续1分钟。最后将磁棒和搅拌套回撤，通过它们的平行移动将磁珠放入下一列孔中液面以下。（2）在第二列孔中，把磁棒从搅拌套中移出，磁珠重新分散到液体中（重悬），搅拌套上下快速移动2分钟（次/分钟），然后将磁珠按同样方法转移重悬到下一列孔中。（3）第三列孔中过程与第二列相同。（4）在第四列孔中，重悬磁珠后，室温下搅拌套上下移动15分钟（50次/分钟），之后再收集转移至下一列孔中。（5）在第五列孔中，重悬洗涤磁珠后，收集并转移到下一列孔中。（6）与第五列孔过程一致。（7）在第七列孔中，重悬磁珠后，搅拌套室温上下移动2分钟（50次/分钟），撤回磁棒和搅拌套。（8）读取信号，使用PerkinElmer监视光强相对值（RLU）。图1基于MB的自动化CLIA定量检测*笔*肽示意图
图1为检测示意图，首先，搅拌MBs-OVA-PCD、mAb3F9和不同浓度*笔*肽标准品样品进行竞争反应。然后，将磁珠洗涤后分散在HRP标抗体溶液中进行孵育反应。最后，将磁珠转移到含有化学发光底物溶液的板孔中，HRP催化底物产生化学发光信号。基于MB的CLIA的整个自动化过程仅需45分钟。每一步进行后，用磁板将深孔板底部外缘磁化5min，肉眼看不到MBs的聚集。检测过程结束时，检测前后各孔液体的UV-Vis谱图，在~nm处吸收峰均未发生偏移，可以认为磁珠在磁分离和磁转移过程中损失忽略不计
3基于MB的自动化CLIA方法优化为了提升CLIA的检测性能，优化了3F9抗体的浓度，酶标抗体浓度，反应缓冲液PH。如图2A-C，RLUmax代表信号强度，IC50代表检测灵敏度，RLUmax/IC50作为评估不同因素对方法性能影响的参数，其值越高说明信号强度更高，灵敏度更高。图2A，随着3F9抗体浓度增加，RLUmax值逐渐增加，浓度为ngmL-1时候RLUmax值最大。但是当稀释浓度为50ngmL-1时，IC50值最小，同时RLUmax/IC50值最大，所以选择50ngmL-1为3F9抗体最佳浓度。同样，选择ngmL-1为HRP酶标抗体最佳浓度。如图2C，选择pH7.4为方法最佳pH。图2优化了基于MB的CLIA参数.（A）mAb浓度，（B）酶标二抗浓度，（C）反应缓冲液pH，（D）检测*笔*肽的标准曲线
4基于MB的自动化CLIA检测性能
首先评估了本方法的灵敏度，在最优条件下建立了检测*笔*肽（PCD和PHD）的标准曲线（图2D），PCDIC50值为0.ngmL-1，PHDIC50值为0.ngmL-1。它们的检测范围分别为0.-1.ngmL-1和0.-0.ngmL-1。分别测定了本方法对α-AMA，β-AMA，γ-AMA的交叉反应率。如图3A所示，所建立的方法对α-AMA，β-AMA，γ-AMA交叉反应率均小于0.1%，证明了方法具有高特异性。同时，对本方法重现性进行了评估，如图3B，本方法具有高稳定性和重现性，甚至当3F9抗体，MB-OVA-PCD和HRP酶标抗体4°C储存30天，其IC50值也没明显的变化。图3（A）对其他鹅膏*肽的交叉反应率，（B）方法稳定性
5基于MB的CLIA对真实样品的分析性能
人尿液样品直接用于检测，无需前处理。1mL人血清样品与1mL甲醇混合，混匀后g离心25分钟。上清氮气吹干，重新溶于1mLPBST用于检测。如表1所示，本方法对PCD和PHD的在人血清和人尿液中LODs分别为0.ngmL-1和0.ngmL-1，其灵敏度比已经报道的传统方法更高。同时也评估了本方法的准确性，如表2所示，*笔*肽批内批间回收率范围为81.6-95.6%，CV不超过12.95。这对于进一步开发真实样品检测提供保障。如表3，对比了本方法和基于HPLC-MS/MS方法对真实人血清和尿液样品中*笔*肽的检测结果，结果显示两种方法没有显著性差异，表明本方法可以用于人血清和尿液实际样品中*笔*肽检测。表1对比本方法和其他方法对*笔*肽的检测性能
表2本方法检测人血清和尿液中*笔*肽回收率及交叉反应率（N=3）a
表3使用本方法和基于HPLC-MS/MS方法检测结果对比
MBs拥有大的特异性表面积，高磁性和良好生物兼容性优势，在间接竞争CLIAs中使用MBs作为载体，通过集成化设备外部磁场操纵磁珠，开发出了基于MB的自动化CLIA用于检测人血清和尿液中*笔*肽。这个全自动的免疫分析过程仅花费45分钟，相比于传统ELISA节约一半时间，减少了人工操作，提升了检测通量和灵敏度。而且本方法检测范围宽，检测限低，拥有特异性，重现性，稳定性和准确性优势。对于真实样品检测，结果与基于HPLC-MS/MS方法一致。这种方法对于临床蘑菇中*的筛选和快速诊断应用前景广阔。JianYuZhuetal.AnAutomatedandHighlySensitiveChemiluminescenceImmunoassayforDiagnosingMushroomPoisoning.FrontiersInChemistry.,(9)
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